De tweekleurige vleermuis is een bewoner van gebouwen en rotskliffen. In gebouwen worden vooral spouwmuren en spleetvormige ruimten in het dak gebruikt. Tweekleurige vleermuizen worden zelden aangetroffen in vleermuiskasten in bossen. Recent zijn grote groepen (vooral mannengroepen) aangetroffen in grote gevelkasten (Fledermausbrettern) (Deschka. C. 200x).